Біологічні науки

УДК 577.352.54

Бурковський Михайло Олексійович

студент кафедри прикладної фізики

Національного технічного університету України

«Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського»

ЗМІНА ЕЛЕКТРОФІЗІОЛОГІЧНИХ ПАРАМЕТРІВ НЕЙРОНІВ ГІПОКАМПА ПРИ ЕКСАЙТОТОКСИЧНОМУ ПОШКОДЖЕННІ

Анотація. У роботі було досліджено зміни електрофізіологічних характеристик, параметрів потенціалу дії, натрієвої та калієвої провідності нейронів гіпокампа щура при ексайтотоксичному пошкодженні. Отримані значення зміни мембранної провідності вказують на те що головну роль в змінах параметрів імпульсації пошкодженого нейрона відіграє зменшення натрієвої провідності.

Ключовi слова: глутамат натрiю, гiпокамп, ексайтотоксичнiсть, провiднiсть, потенцiал дії, іонні канали, імпульсація, деполяризація.

Вступ. Здатність нейрона проводити, передавати та отримувати електричні сигнали зумовлена відкриттям та закриття специфічних білкових іонних каналів. Тимчасова зміна проникності поверхні клітини для іонів Na⁺ та К⁺ визначає утворення потенціалу дії, що в свою чергу забезпечує зв’язок нейронів між собою та іншими клітинами організму. Кожен відкритий канал дозволяє лише невеликій кількості іонів переміститись з однієї сторони мембрани в іншу, при цьому викликаючи значні зміни мембранного потенціалу.

В експерименті культивовані нейрони гіпокама щура піддавались ексайтотоксичному пошкодженню у вигляді аплікаці натрієвої солі глутамінової кислоти в концентрації 100 мкмоль/л, в результаті чого були зафіксовані та проаналізовані зміни електрофізіологічних параметрів нейрона. Головну увагу в роботі зосереджено на зв’язку зміни значення Na+ та К+ провідності зі змінами характеристик потенціалу дії: частоти генерації, амплітуди, тривалості, швидкості деполяризації та реполяризації.

Проведення експерименту. Електрофізіологічну реєстрацію струмів від нейронів гіпокампа щура проводили з використанням підсилювача AxoClamp 200B в конфігурації «ціла клітина» при кімнатній температурі з використанням зовнішньоклітинного фізіологічного розчину наступного складу (ммоль/л): NaCl – 140, KCl – 3, CaCl2, MgCl2 – 2, Hepes – 10, глюкоза – 12, рН – 7,4. Електроди-піпетки заповнювали внутрішньоклітинним розчином (ммоль/л): глюканат калію – 100, KCl – 50, MgCl2 – 5, EGHTA – 10, Hepes – 20, рН – 7,4 [1, с. 4].

Дослід розділявся на дві частини: реєстрація сигналу від клітин що перебували в контролі та реєстрація сигналу від тих самих клітин після впливу L-натрієвої солі глутамінової кислоти (Glu) у концентрації 100мкМ/л.

В ході проведення електрофізіологічного досліду після формування конфігурації «ціла клітина» безпосередньо за показниками підсилювача визначали потенціал спокою нейрона, після чого нейрон в режимі фіксації потенціалу підтримували при потенціалі -70 мВ, пропускаючи відповідний гіперполяризуючий струм (10-150 пА). Нейрони активували прикладанням деполяризуючих командних імпульсів тривалістю 200 мс від підтримуваного потенціалу з інкрементом 10 мВ. При цьому реєстрували відповідний потенціалзалежний (інтегральний) струм [1, с. 4].

Після контрольної реєстрації експериментальну камеру протягом 5 хвилин перфузіювали зовнішнім фізіологічним розчином з доданою натрієвою сіллю глютамінової кислоти в концентрації 100 мкмоль/л . Після відмивання нормальним зовнішнім розчином електрофізіологічні характеристики нейрона вимірювали повторно. Значення амплітуди струмів коректувалось з врахуванням змін струму витоку, викликаного змінами опору мембрани пошкоджених нейронів. На Рис.1 проілюстровано приклад зареєстрованого потенціалзалежного струму нейрона гіпокампа щура до та після впливу глутамату.

Рис.1. Потенціал-залежний струм культивованих нейронів гіпокампа щура в контролі (а) та після ексайтотоксичного пошкодження(б)

В ході досліду вдалось записати сигнал потенціал-залежного струму в контролі та після впливу глутамата для 5-ти клітин. Подальший аналіз струму нейронів та вивчення заміни його характеристик проводили за допомогою програмного пакета Сlampfit 10.3. Визначенні в процесі обробки сигналу характеристики нейронів представлено у вигляді: середнє±стандартна похибка середнього. Гіпотези про відмінність відповідних середніх перевірялась за критерієм Стьюдента з рівнем значимості 0,05.

Результати і обговорення. В ході досліду вдалось записати сигнал потенціал-залежного струму в контролі та після впливу глутамата для 5-ти клітин. Подальший аналіз струму нейронів та вивчення заміни його характеристик проводили за допомогою програмного пакета Сlampfit 10.3.

Отримані результати показують що середнє значення опору та потенціалу спокою клітин в контролі: R=2,1±0,8Гом, U=-51,8±5,4мВ та після впливу глутамату: R=1,1±0,4 ГОм U=-27,4±7,2 мВ, в свою чергу значення провідностей для натрієвого струму при фіксованому потенціалі величиною +40мВ змінюється від -1000±200пА до -500±100пА (40±9%), а калієвої провідності від 1100±200пА до800±200пА.(25±8%). Гіпотези про відмінність відповідних середніх перевірялась за критерієм Стьюдента з рівнем значимості 0,05.

Потенціал дії для нейрона після ексайтотоксичного пошкодження [1, с. 6]. відповідно до експериментальних даних має наступний вигляд (Рис.2).

Рис. 2. Потенціал дії нейронів гіпокампа до(ліворуч) та після(праворуч) аплікації глутамату. Калібрування: 20мВ, 20с.

У якості характеристики що описує 5 хвилинний вплив глутамату у концентрації 100 мкМ на клітину гіпокампа виберемо значення вхідного та вихідного струмів при мемебранному потенціалі U=+40 мВ. Зміни характеристик потенціалу дії в наслідок зміни провідності каналів відповідають: амплітуда ПД зменшилась від 91±4 до 65±5 мВ, тривалість ПД збільшилась від 4,3±0,4 до 9,5±1,6 мс, максимальна швидкість деполяризації змінилась від 56 до 27 мВ/мс, максимальна швидкість реполяризації змінилась від -29 до -20 мВ/мс.

Отримані результати кількісно характеризують ексайтотоксичний вплив на основні електрофізіологічні характеристики нейронів та свідчать, що описані зміни, викликані пошкодженням у характері імпульсації нейрона виникають головним чином завдяки зменшенню потенціал-залежного натрієвого струму.

Висновки. В роботі встановлено, що в наслідок ексайтотоксичного пошкодження глутамату суттєво (приблизно удвічі) зменшуються потенціал спокою, опір мембрани та амплітуда натрієвого струму, а також помірно (близько 20%) зменшується амплітуда калієвого струму. Дані результати кількісно описують ексайтотоксичний вплив на основні електрофізіологічних характеристик нейронів (порогового значення, амплітуди, швидкості деполяризації та реполяризації), та свідчать що описані зміни в характері імпульсації культивованих нейронів гіпокампа виникають головним чином за рахунок зменшення потенціал-залежного натрієвого струму. Також в процесі аналізу отриманих результатів у 40% клітин спостерігався швидкоінактивуючий вихідний (калієвий) струм зі значною зміною своєї амплітуди (приблизно удвічі) . Характерна зміна даної провідності викликає великий інтерес та потребує додаткового вивчення через малу вибірку прояву даного ефекту.

Оскільки концентрація глутамату в головному мозку підвищується в широкому колі нейродегенеративних захворювань, то отримані дані зміни характеристик потенціалу дії можуть бути використані для подальшого вивчення протекторних можливостей деяких речовин.

Література

1. Протекторна дiя пептиду пролiн-глiцин-пролiн на електрофiзiологiчнi властивостi культивованих нейронiв гiпокампа при ексайтотоксичному пошкодженнi / В.Ю. Маслов, М.С. Веселовський, А.О. Москалюк та iн.— Фiзiологiчний журнал Т.60 №2, 2014.